大鼠骨髓来源的内皮祖细胞体外培养方法

1. SD大鼠，250g，通过颈椎脱位处死大鼠，浸入75%乙醇浸泡5分钟，转移到通风柜中的解剖盘中。

2. 打开皮肤，暴露、收集股骨，无菌状态下移除附着的肌肉和组织。

3. 并转移股骨至预冷含双抗的PBS中，洗涤三次。冰上操作。

4. 切断股骨骨骺， 使用5mlPBS，1ml注射器针头冲洗，冲洗液由棕色变成粉红色即可（股骨变白）。冲洗后，用1ml注射器吹打3-5次。

5. 70um滤网过滤，弃去筛网。使用 15ml 离心管，先加入分离液，然后缓慢加入滤过的悬液。20℃环境下，600g 离心 25min。

6. 离心后，离心管中液体由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色单个核细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。

7. 小心吸取离心管中的，环状乳白色单个核细胞层，转移到新离心管中，加入 5-10ml 洗涤液，混匀细胞。400g，离心 10min。

8. 弃去上清，用吸管吸取 5ml 清洗液重悬所得细胞。 250g，离心 10min，弃去上清。 再用M199完全培养基（含10 ng/mL VEGF，1 ng/mL b-FGF，1 ng/mL EGF，20%胎牛血清、1%双抗）清洗一次，弃去上清，M199完全培养基重悬细胞。250g，离心 10min，弃去上清。M199完全培养基重悬细胞，计数。

9. 按3×10⁶/孔种入纤连蛋白包被过的24孔板，每3天换一次培养基，以去除非贴壁细胞，持续诱导培养2-3周。