小鼠脾脏CD8+T细胞的磁珠分选

一、制备脾脏单细胞悬液

8周龄C57BL/6小鼠摘眼球放血，无菌分离脾脏，于70um滤网上研磨收集脾细胞，过滤、离心，再以RPMI-1640完全培养液重悬。

二、磁珠标记

1. 细胞计数为8×10⁷/mL。

2. 400×g离心4分钟，去除上清。

3.每10⁷个细胞总量使用40μL缓冲液重悬。

4.每10⁷个细胞总量添加10μL CD8+T细胞生物素抗体混合物。

5.混匀，4℃孵育 5分钟。

6.每10⁷个细胞加入2mL缓冲液洗涤细胞，400×g离心4分钟，去上清。

7.每10⁷个细胞添加80μL 缓冲液。

8.每10⁷个细胞添加20μL抗生物素磁珠。

9.混匀，4℃孵育 10分钟。

三、磁珠细胞分选  

1. 将LS分选柱置于相对应的分选器中。

2. 用适当体积的缓冲液润洗分选柱.

3. 将细胞悬液转移至分选柱中，收集含有未标记细胞的流出液，即 CD8+T细胞。

4. 加适量的缓冲液，收集总流出物，并与步骤3中的流出液混合，这是CD8+T细胞。

四、流式鉴定

1. 将磁珠分选后得到的CD8+T细胞悬液离心，400 ×g，4min，弃去上清。

2. 细胞沉淀中加入1 mL完全培养基，计数。

3. 从中取出两份细胞（一份大概1×10⁶个细胞），设置为blank和CD8+T染色组。

4. CD8+T染色组加入200 μL流式染色缓冲液，再加入5 μL Anti-Mo CD8a，吹打均匀，常温避光孵育15min；

5. 孵育结束后，PBS洗涤细胞，离心去上清；

6. 加入200 μL流式染色缓冲液，上机检测。