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研究人员发现肺癌中IL6的N-糖基化缺陷会诱导癌细胞转移和对表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）产生耐药性，揭示了其潜在机制，为肺癌治疗提供了新的理论依据和潜在靶点。
研究背景：
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）是携带敏感EGFR突变的肺腺癌患者的标准治疗方法，但大多数患者会产生获得性耐药。IL6与受体结合后可激活多种信号通路，在肺癌进展和耐药中起重要作用，但IL6的糖基化修饰对其功能的影响尚不清楚。
研究模式图：
在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中，在未接受EGFR TKI治疗的环境下，自分泌的IL6（NG-IL6）主要在N73位点发生N-糖基化修饰，在T170位点发生O-糖基化修饰。NG-IL6主要激活经典的JAK-STAT3轴，促进细胞增殖。然而，长期使用EGFR TKI治疗会导致IL6分泌增加，同时抑制N-糖基转移酶复合物成分（主要是STT3A或STT3B、RPN1/2、DAD1和 DDOST）的表达。这种抑制作用使得NG-IL6在N73位点的N-糖基化减少，进而导致NG-IL6在N73位点的N -糖基化进一步降低。结果是，获得耐药性后，NG-IL6的比例下降，而N-糖基化缺陷型IL6（deNG-IL6）的比例增加。反过来，deNG-IL6将信号偏好从JAK-STAT3轴转移到SRC-YAP-SOX2轴。这种替代激活的SRC-YAP-SOX2信号促进细胞可塑性，并导致耐药性的产生。
图1.长期EGFR TKI治疗诱导deNG-IL6驱动肿瘤耐药。
研究方法:
细胞系与动物模型 ：使用多种肺癌细胞系和正常支气管上皮细胞系，建立了Osimertinib耐药细胞系和小鼠移植瘤模型。
样本采集：收集肺癌患者的恶性胸腔积液（MPE）和配对的肺癌组织，包括未接受TKI治疗和TKI耐药患者的样本。
实验技术：采用Western blotting、ELISA、基因集富集分析（GSEA）、免疫沉淀、质谱分析、细胞迁移和侵袭实验、动物体内转移实验等多种技术手段。
主要研究结果：
1. IL-6的N-糖基化修饰
图2 肺癌细胞中IL-6的N-糖基化修饰
从肺癌患者恶性胸腔积液（MPE）中分离的肺腺癌细胞和多种肺癌细胞系分泌的 IL6 存在两种形式（H-IL6和L-IL6，重链/轻链），且H/L比值于不同细胞系间存在差异。GSEA分析发现与N-糖基化过程相关的基因在癌症组织中富集。抑制剂处理和酶切实验等证实H-IL6的形成依赖于N-糖基化修饰。
2. N-糖基化IL6促进酪氨酸磷酸化STAT3的核滞留而deNG-IL6诱导EMT的基因特征
图3 N-糖基化IL6促进酪氨酸磷酸化STAT3的核滞留
研究者预测了两个潜在的N-糖位点（N73和N172）和四个可能的O-糖位点（T166，T171，T170和S174）存在于hIL 6中。MS结果表明聚糖链位于N73、N172和T170，结合通过WB结果分析确定了IL6聚糖链的主要附着位点是N73 + T170，而非N172 + T170。
构建野生型和突变型IL6质粒转染细胞，发现N73Q-IL6缺失H-IL6条带，表明N73位点的糖基化对IL6功能有重要影响。构建野生型和突变型IL6质粒转染细胞，发现N73Q-IL6缺失H-IL6条带，表明N73位点的糖基化对IL6 功能有重要影响。与N73Q-IL6相比，NG-IL6可促进STAT3的酪氨酸磷酸化和核滞留，延长STAT3激活时间；而N73Q-IL6则诱导 STAT3激活时间缩短，并改变下游信号偏好，激活SRC-YAP-SOX2轴；此外，N73Q-IL6可诱导上皮-间质转化（EMT）相关基因表达，促进肺癌细胞的迁移和侵袭能力，在体内可增强肺癌细胞的转移能力，且这些作用可被针对SRC、YAP 和SOX2的抑制剂或shRNAs抑制；
图4 deNG-IL6诱导非小细胞肺癌的EMT、迁移和转移
此外，EGFR-TKI处理可诱导deNG-IL6的增加，IL6糖基化状态的这种变化可以将GP130受体的下游信号传导从JAK-STAT 3切换到SRC-YAP-SOX2。同时，具有高水平deNG-IL6的肺癌细胞倾向于具有EMT相关特性，可转移到其他器官，并表现出对EGFR-TKI的抗性。
图5 deNG-IL6将GP130信号偏好从JAK-STAT3切换到SRC-YAP轴
图6 SOX2参与deNG-IL6诱导SRC-YAP轴驱动的肿瘤细胞迁移和转移
3. Osimertinib诱导deNG-IL6的表达及SRC-YAP-OX2轴的激活
长期使用EGFR-TKI Osimertinib治疗可诱导NG-IL6表达减少和deNG-IL6升高，从而导致肺癌细胞对EGFR-TKI产生耐药性。
图7 Osimertinib诱导deNG-IL6的表达和随后SRC-YAP-OX2轴的激活
阻断IL6的受体GP130和GP80后，各种细胞系中由WT-IL6和N73 Q-IL6所诱导的STAT 3活性降低，而SRC-YAP轴信号的激活增加，这些数据表明 OR细胞分泌的deNG-IL6不仅维持细胞存活，也有利于细胞迁移。
4. EGFR-TKI耐药的NSCLC患者表现出高deNG-IL6表达和从JAK-STAT3到SRC-YAP的轴信号移位
为了证明deNG-IL6在NSCLC患者中的存在，研究从对EGFR TKIs具有naïve（治疗前）或耐药（发生耐药后）的患者的MPE中分离出MPECs， naïve MPECs分泌H-IL6 多于 L-IL6，而在EGFR TKIs耐药MPECs中则相反。同时，RNA测序的富集结果表明，N-糖基化过程在OSTu中增强 而在ORTu中减弱。
图9 EGFR-TKI耐药的NSCLC患者表现出高deNG-IL6表达和从JAK-STAT3到SRC-YAP的轴信号移位
EGFR-TKI 耐药患者的MPECs中deNG-IL6比例增加，且肿瘤组织中STAT3信号减弱，SRC信号增强，进一步证明了deNG-IL6与耐药和转移的相关性临床样本分析显示，EGFR-TKI 耐药患者的MPECs中deNG-IL6比例增加，且肿瘤组织中STAT3信号减弱，SRC信号增强，进一步证明了deNG-IL6与耐药和转移的相关性。
研究结论：
1. 在NSCLC中，IL6主要在N73位点发生N-糖基化修饰，该修饰影响其下游信号通路的激活，N-糖基化缺陷的IL6可诱导EMT、迁移、转移和耐药。
2. EGFR-TKI治疗可降低肺癌细胞中N-糖基化相关酶的表达，导致IL6的N-糖基化减少，进而激活SRC-YAP-SOX2轴，促进癌细胞的可塑性和耐药性。
3. 监测IL6的糖基化状态可能有助于预测肺癌的进展和EGFR-TKI耐药性，为肺癌的治疗提供新的潜在靶点和生物标志物。
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