Western Blot

样品准备

组织样品：

将组织剪成细小的碎片，按每20mg组织加入150-250μl裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂），匀浆器匀浆直至完全裂解。裂解后的样品4℃ 12000g 离心15分钟，取上清，进行蛋白质定量后贮存于-80℃冰箱。

1.蛋白定量；

2. 根据样品数量，将BCA试剂A与试剂B按体积比为50:1配制适量BCA工作液，充分混匀；

3. 各孔加入160μl BCA工作液；

4. 把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下测定吸光度。以吸光值为横坐标，蛋白浓度（μg/μl）为纵坐标，绘出标准曲线；

5. 在酶标板中加入2μl待测蛋白和18μl PBS（稀释10倍），加入160μl BCA工作液，把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下测定吸光度。

6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白浓度（μg/μl），乘以样品稀释倍数（10）即为样品实际浓度（单位：μg /μl）。

PAGE胶的制备

1. 下层分离胶的制备

    根据目的蛋白的分子量选择不同的凝胶浓度，高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓度胶分离。   P62 60kDa   LC3B 14，16kDa  GAPDH  37kDa   故选用  10%  和15%  的胶。   不同浓度的分离胶按下表进行配制，待下层胶凝固后进行上次浓缩胶的配制。

2. 上层浓缩胶的配制

根据需要按下表配制浓缩胶，并插好梳子。

上样及电泳

1. 上样

每孔上样量约为       15    μl蛋白，可以根据实验要求加大上样量。根据蛋白定量结果取所需蛋白加入适量上样缓冲液，沸水浴10min后离心取上清上样。将配制好的PAGE胶放入电泳槽中，加入适量电泳缓冲液，取下梳子用枪轻轻吹打加样孔，避免孔内有余胶残留影响上样。将准备好的样品用加样枪慢慢加到对应的孔内，注意勿溢出加样孔。

2. 电泳

一般浓缩胶80V 20分钟，分离胶120V 60分钟，可以根据具体实验要求调整电压和时间。当染料到达胶底部时切断电源，停止电泳，进行下一步转膜。

转膜

转膜分为湿转和半干转，本实验室选用半干转。    

半干式转膜中，三明治的排列为：/虑纸/胶/膜/虑纸，用电转缓冲液浸湿后，直接置于电转仪的正负极之间。胶于负极而膜置于正极。半干式的电转缓冲液不同于湿式的电转缓冲液，推荐为：48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇。25V转膜30分钟即可。转膜前将PVDF膜在甲醇中浸泡1-2 分钟（NC膜在电转液中浸泡10-20分钟），再孵育于冰冷的电转缓冲液中5 分钟，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡3-5 分钟，否则转膜时会导致条带变形。

膜上蛋白的检测

    为检测转膜是否成功，可用丽春红染色，丽春红染色工作液：2%的丽春红贮备液1：10 稀释，即加9 倍的ddH2O

染色方法：将膜放入TBST 洗一次，再置于丽春红染色工作液中,在室温下摇动染色5 分钟，大量的水洗膜直至水变清无色蛋白条带清晰，（膜也可以用TBST 或水重新洗后再进行染色）PVDF 膜需用甲醇再活化后用TBST洗后进行封闭。

膜的封闭及抗体孵育

1. 封闭：5%脱脂奶粉（检测磷酸化蛋白用BSA）室温封闭1小时或4℃过夜。

2. 一抗：根据说明书   P62 1：1000  LC3B 1：1000    GAPDH 1：2000  稀释抗体，抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，和膜室温孵育2小时或4 ℃孵育过夜。

3. 二抗：孵育一抗的膜用TBST洗涤3次，每次5min。随后根据用量，按照1:1000稀释HRP标记的二抗，与膜37℃孵育1h。用TBST洗涤3次，每次5min。

显色

ECL化学发光检测：配制ECL发光液，根据用量，取ECL发光液A和B等量混匀，加在膜的正面暗室避光5分钟。倒掉显色液，用纸小心吸取显色液，在上面盖上一层平整的透明纸。将其放入成像系统中进行扫描。可以根据条带强弱再次感光或减短感光时间已达到理想结果。